|
|
In vitro kultivace zárodečných kmenových buněk jesetera
XIE, Xuan
Tato studie se zabývá výzkumem biologie zárodečných buněk jesetera, včetně jejich charakterizace, purifikace a in vitro kultivace. Výzkumné cíle jsou: popis vlastností spermatogoniálních kmenových buněk a regulace spermatogeneze; hodnocení stávajících metod purifikace a in vitro kultivace zárodečných kmenových buněk ryb; výzkum in vitro množení zárodečných buněk jesetera; vývoj metody purifikace zárodečných buněk jesetera; identifikace spermatogonií typu A (ASG) u jesetera. Novost a vědecká originalita. Tato práce jako první vyvinula množení zárodečných buněk jesetera in vitro a zkombinovala buněčnou kultivaci a transplantaci. Aplikace monoklonálních protilátek a rozpoznání ASG jesetera representuje nový a v současné době jediný nástroj pro identifikaci zárodečných buněk. Důležitost řešení vědeckého problému v daném výzkumném oboru. Při práci kultivace zárodečných buněk byl pozorován efekt somatických buněk a růstových faktorů na proliferaci jeseteřích zárodečných buněk pomocí hodnocení mitotické aktivity zárodečných buněk během kultivace, která přispěla ke studiu regulačních mechanizmů sebeobnovy zárodečných buněk a jejich diferenciace. V této dizertační práci byly vyvinuty metody purifikace ASG jesetera pomocí průtokové cytometrie. Byla nalezena monoklonální protilátka umožňující specifickou identifikaci ASG jesetera. Teoretický význam a aplikační hodnota výsledků. Dizertační práce sumarizuje nahromaděné znalosti o spermatogoniálních kmenových buňkách a regulaci jejich sebeobnovení vs. diferenciace u ryb, porovnává dostupné protokoly a pokroky v izolaci spermatogonií a zhodnocuje vývoj podmínek in vitro kultivace zárodečných buněk. Efektivní izolace spermatogonií typu A bylo dosaženo na základě jejich fyzikálně-chemických vlastností, které jsou aplikovatelné pro komerční i ohrožené druhy ryb bez použití buněčných barvících systémů jako transgenoze nebo protilátky povrchu buňky. Monoklonální protilátky vytvořené pro tuňáka mohou rozpoznat také antigen ASG jesetera malého, naznačující, že epitopy pro ASG jsou mezi druhy konzervované. Tyto vědecké výsledky představují charakterizaci ASG na proteomické úrovni. Implementace vědeckých výsledků. Byly vyvinuté sérum prosté kultivační podmínky zárodečných buněk jesetera. Zárodečné buňky si v těchto in vitro podmínkách udržely růst, přežití a schopnost transplantace více než 40 dní. Předpokládá se, že tato metoda poskytne dlouhodobé zásobování zárodečných buněk k transplantacím a reprodukcí pomocí náhradních rodičů. Navíc, purifikované populace ASG byly izolovány na základě analýzy vlastností rozptylu světla zárodečných buněk. Pro sortování nebylo použito žádné barvivo ani transgenoze, což je výhodné pro další charakterizaci buněk a následné aplikace. Aplikace monoklonálních protilátek na ASG jesetera můžeme docílit přesné identifikace ASG v in vitro kulturách.
|
|
|
The foundation of maternal factors in sturgeon: from oocyte to embryo
POCHERNIAIEVA, Kseniia Kostyantynivna
Pokles početnosti divokých populací jesetera v posledních desetiletích vedl k rostoucímu zájmu o využití různých biotechnologických postupů vedoucích k ochraně nebo obnově těchto ohrožených druhů. Produkce chimér, transplantace zárodečných buněk nebo produkce pomocí tzv. "náhradního rodiče" by mohly rozšířit spektrum technik používaných k záchraně druhu či vést k obnově rybích populací. Úspěšná aplikace těchto metod u jeseterů vyžaduje znalost jeho embryonálního vývoje a informace o struktuře a charakteristikách samotného jeseteřího oocytu. K odhalení intracelulární geometrie, morfogenetických aspektů, mechanismů organizace mateřských determinantů a jejich pozdější reorganizace byly v rámci této práce použity techniky qPCR tomografie, inhibice transkripce a vizualizace jader. qPCR tomografie se ukázala jako spolehlivá technika pro stanovení úlohy genů detekovaných v animalní a vegetativní hemisféře oocytů jesetera a také pro identifikaci profilů těchto genů u ranných vývojových stádií embryí jesetera. qPCR tomografie byla v zásadě provedena ve dvou krocích: předběžné kroky tomografie a samotná RT-PCR. Optimálně orientované oocyty byly rozřezány na 30 ?m a sekce (prokrývající jak animalní tak vegetativní pól), u který byla následně provedena celková extrakce RNA. 12 vybraných maternálních genů: [actb, ppia, alas1, sdha, ywhae, dnd, vasa, vegt, wnt11, ddx25, otx1 a gdf1] bylo sledováno pomocí RT-PCR. Identifikovány byly dvě skupiny transkriptů klasifikovaných jako animalní nebo vegetativní geny s jasným gradientem. Primární geny zárodečné plasmy - markery jako dnd, vasa, ddx25 byly lokalizovány směrem k vegetativnímu pólu. To vysvětluje, kde presně se nachází prapohlavní zárodečné buňky v oocytech jesetera malého. Dalším aspektem použití této techniky byla srovnávací analýza profilů RNA v oocytech drápatky Xenopus laevis a jesetera malého Acipenser ruthenus. Byla zjištěna jednoznačná podobnost v lokalizaci molekul mRNA u těchto dvou druhů. Takovéto podobnosti v expresních profilech vzdáleně příbuzných druhů naznačují, že jejich dávní předkové mohli vzniknout z více příbuzných linií. alpha-Amanitin jako transkripční inhibiční faktor byl použit ke stanovení zygotického genomového přechodu v embryích jesetera malého. Přechod z mateřského na zygotický typ transkripce je charakterizován eliminací mateřských transkriptů a pokračuje produkcí zygotických transkriptů. U jesetera malého byl tento přechod identifikován po desátém štěpení - během pozdní blastuly, kdy počet buněk v blastomeře překročil 1000. Morfologické změny během přechodu mid-blastuly představují milníky ve vývoji metazoanů, protože každá buňka přenáší perfektní kopii svého genomu v každé divizi. Embrya vzniklá křížením jiker jesetera malého A. ruthenus a spermatu jesetera ruského Acipenser gueldenstaedtii druhů s odlišnou ploidní úrovní byla vytvořena za účelem zvýšení obsahu DNA v jádrech buněk. Nukleární vizualizace barvením 4'-6-diaminido-2-fenylindolem (DAPI) ukázala, že se buňky dělí synchronně konstantní rychlostí až do MBT v devátém buněčném cyklu u kontrolních embryí, která odpovídají 1000 buněčnému stadiu (13 hpf). Hybridní embrya jesetera malého a ruského vykazovala přechod od synchronního k asynchronnímu dělení v osmém buněčném cyklu, což je stadium 512 buněk (12 hpf). U jesetera malého i hybridních embryí došlo k přechodu během 1 hodiny. Embrya jesetera injikovaného alpha-Amanitinem také vykazovala kinetiku buněčného cyklu podobnou kontrolám, a to bez zpoždění nebo malformace během štěpení, což s největší pravděpodobností naznačuje, že MBT u jesetera probíhá nezávisle na začátku produkce zygotických transkriptů.
|
|
|
Diferenciace totipotentních zárodečných buněk u larev ptačích schistosom
Peštová, Jitka ; Horák, Petr (vedoucí práce) ; Chanová, Marta (oponent)
Tato diplomová práce se zabývá vývojem larválních stadií motolice Trichobilharzia regenti v mezihostiteli, diferenciací zárodečných buněk a rozlišením mezi sporocystogenezí a cerkáriogenezí ve sporocystách za účelem určení, zda během vývoje ptačích schistosom v mezihostiteli může docházet ke vzniku více generací dceřiných sporocyst stejně jako je tomu u lidských schistosom rodu Schistosoma. Bylo popsáno pět vývojových stadií dceřiných sporocyst a deset vývojových stadií cerkárií. Prvním stadiem u obou larev je zárodečná buňka, která svým dělením dává vzniknout agregátu buněk. Poté se na povrchu zárodku vytváří obal, tzv. primitivní epitel, a zárodek se prodlužuje. Následující vývoj larev již probíhá odlišně. Dceřinou sporocystu pak lze od cerkárie rozlišit ve stadiu, kdy je vytvořen tegument. Dceřiná sporocysta má v tomto stadiu charakteristické červovité vzezření a její tělní dutina obsahuje množství zárodečných buněk. Pro cerkárie s vytvořeným tegumentem je charakteristická přítomnost penetračních žláz.
|
|
|
Manipulace zárodečných buněk jako nástroj pro management a produkci izogenních linií u ryb
FRANĚK, Roman
Izogenní linie ryb představují základní možnost kontroly genetického pozadí pokusných organismů, jelikož všichni jedinci z dané izogenní linie sdílejí stejný genotyp. Izogenní linie ryb byly dosud produkovány pouze opakovanou uniparentální dědičností - androgenezí a gynogenezí. V první generaci je produkováno homozygotní potomstvo, následně každý homozygotní jedinec po opětovné indukci uniparentální dědičnosti produkuje odlišnou izogenní linii. Navzdory optimalizovaným postupům pro indukci uniparentální dědičnosti byly izogenní linie úspěšně produkovány pouze u několika druhů ryb. Jejich dlouhodobé udržování je značně problematické z důvodu nízké životaschopnosti a nepříznivých reprodukčních charakteristik. Situace je dále komplikována tím, že izogenní linie jsou zpravidla přirozeně monosexní, kdy pro další reprodukci je nutné znovu použít uniparentální dědičnosti, nebo provést zvrat pohlaví u části jedinců. V této dizertační práci bylo provedeno několik typů manipulací se zárodečnými buňkami. Byly vyvinuty a optimalizovány protokoly pro kryokonzervaci spermatogonií a oogonií za účelem maximalizace jejich životaschopnosti po rozmrazení. Fyziologická aktivita kryoprezervovaných buněk byla potvrzena transplantací do náhradního hostitele. Kryoprezervované a následně transplantované buňky si v porovnání s nezamraženou kontrolou zachovaly srovnatelnou kolonizační aktivitu, byly schopny se transdiferenciovat ze spermatogonií na oogonie. Úspěch transplantace byl následně potvrzen detekcí exprese genů spojených s gametogenezí u kapra pomocí RT-PCR. V další studii byly zárodečné buňky z homozygotních donorů kapra obecného transplantovány do náhradních rodičů - karas obecný zlatá forma, kteří byli sterilizováni pomocí tlumení exprese genu zodpovědného za vývoj a migraci zárodečných buněk. Tento postup má potenciál zvýšit šanci na produkci životaschopný gamet. Zárodečné buňky homozygotů s různým stupněm poškození gameteogeneze mohou být přeneseny do plně životaschopných hostů a tím celkově zvýšit efektivitu produkce izogenních linií. Použití karase zlatého jakožto náhradního rodiče navíc zajistí, že část chimér zárodečné linie budu samci a část samice, tím pádem budou produkovány gamety obou pohlaví a pro další reprodukci izogenní linie nebude nutné dalších zásahů, které jsou běžně nutné pro udržitelnost izogenní linie. Vhodnost triploidních recipientů pro transplantaci zárodečných buněk, kteří mohou být potenciálně použity jako recipienti pro buňky z homozygotů za účelem produkce izogenních linií, byla potvrzena u kaprovitých ryb na modelu dánia pruhovaného. Spermatogonie a oogonie z diploidních donorů byly transplantovány do uměle indukovaných triploidních larev. Po dosažení pohlavní dospělosti byly získány spermie původem z transplantovaných buněk donora. Oogonie se transdiferenciovaly do spermatogonií a byly produkovány spermie s pohlavními chromozomy samic, které mohou být zajímavé pro další studie determinace pohlaví u dánia pruhovaného. Dále byla vyvinuta nová technika pro přenos zárodečné linie linií byla vyvinuta s použitím embryí dánia pruhovaného. Buňky dárce byly transplantovány ze stádia blastuly do rozplavaných larev. S tímto přístupem byly nediferencované primordiální zárodečné buňky schopny kolonizovat genitální rýhu a zahájit gametogenezi. Po dosažení pohlavní dospělosti chimér zárodečné linie byly získány gamety a životaschopné potomstvo. Ačkoli celková účinnost této metody byla ve srovnání s jinými transplantačními metodami nižší, tato studie může mít význam pro záchranu zárodečné linie u málo životaschopných embryí nebo letálních mutantů.
|
|
|
Právní problematika zárodečných buněk ve vztahu k asistované reprodukci
Stieranková, Aneta ; Frinta, Ondřej (vedoucí práce) ; Thöndel, Alexandr (oponent)
Práce se zabývá problematikou asistované reprodukce s konkrétním zaměřením na zárodečné buňky a některé otázky, které jsou s nimi spojené. Pro lepší pochopení rozporuplných názorů a pohledů na konkrétní problematiku je porovnána česká právní úprava s britskou právní úpravou. Následně je pak v každém jednotlivém případě uvedeno vyhodnocení toho, která země pojala daný problém lépe, především za využití komparativní metody. Úvod práce se věnuje asistované reprodukci obecně, a to zejména z hlediska vymezení pojmů a historického vývoje této problematiky. Následně je vymezen základní právní rámec pro asistovanou reprodukci jak v České republice, tak ve Velké Británii. Krátce jsou též shrnuty nejzákladnější požadavky, které jsou na dárce zárodečných buněk v obou zemích kladeny. Z hlediska konkrétních problémů pojících se k zárodečným buňkám, se větší část práce soustředí na anonymitu dárců spermatu, zejména pak na shrnutí nejdůležitějších argumentů jejích odpůrců a na následné vyvrácení těchto argumentů. Závěrem této kapitoly je pak odůvodnění toho, proč by podle mého názoru anonymita dárců spermatu měla být zachována. Další část je věnována finanční odměně za darování zárodečných buněk, její přípustnosti a výši. V této kapitole je zejména shrnuta argumentace odpůrců poskytování finančních odměn. Na...
|
|
|
Kryoprezervace a transplantace spermatogonií kapra obecného
FUČÍKOVÁ, Michaela
Kryoprezervace a transplantace zárodečných buněk u ryb poskytuje vhodný nástroj pro zachování genetické informace. Metodou náhradních rodičů lze získat potomstvo se znaky zvoleného donora, v tomto případě komerčně důležitého, kapra obecného. Pro úspěšnou kryoprezervaci zárodečných buněk ryb ale musí být stanovený vhodný protokol individuálně pro každý druh. V případě této práce se testovalo několik kryoprotektantů. U nejlepšího z nich, Me2SO, co se životaschopnosti spermatogonií týče, se testovaly jeho různé koncentrace v závislosti na rychlosti zamrazování. Dále následovalo testování vlivu velikosti zamrazované tkáně, inkubačního času a přidaného cukru. Výsledkem testování bylo kryomédium sestávající se z 2,5M dimethylsulfoxidu, přidaného cukru 0,3M glukózy, 1,5% BSA a 25nM Hepes rozpuštěného v PBS. Jako nejvhodnější byla stanovena velikost zamrazované tkáně 100 mg, inkubační čas 30 min a rychlost zamrazování -1 °C/min. Tento výsledek zajišťuje nejvyšší míru přežití kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného a nabízí optimální podmínky pro jejich zamrazování. Druhou částí práce bylo ověření úspěšnosti transplantace kryoprezervovaných a i čerstvých spermatogonií do vhodně zvoleného recipienta, jímž je karas zlatý, který s kaprem obecným sdílí obdobné reprodukční charakteristiky, ale zároveň nabízí i snížení nároků na prostor, nebo odolnost vůči koi-herpes viru. Transplantované zárodečné buňky kolonizovaly zárodečnou rýhu a spustily gametogenezi celkem u 42,5 % (kryoprezervované spermatogonie) a 52,5 % (čerstvé spermatogonie) recipientů karase zlatého, což prokázalo, že transplantace kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného, do recipienta karase zlatého, je úspěšně realizovatelná.
|
|
|
Diferenciace totipotentních zárodečných buněk u larev ptačích schistosom
Peštová, Jitka ; Horák, Petr (vedoucí práce) ; Chanová, Marta (oponent)
Tato diplomová práce se zabývá vývojem larválních stadií motolice Trichobilharzia regenti v mezihostiteli, diferenciací zárodečných buněk a rozlišením mezi sporocystogenezí a cerkáriogenezí ve sporocystách za účelem určení, zda během vývoje ptačích schistosom v mezihostiteli může docházet ke vzniku více generací dceřiných sporocyst stejně jako je tomu u lidských schistosom rodu Schistosoma. Bylo popsáno pět vývojových stadií dceřiných sporocyst a deset vývojových stadií cerkárií. Prvním stadiem u obou larev je zárodečná buňka, která svým dělením dává vzniknout agregátu buněk. Poté se na povrchu zárodku vytváří obal, tzv. primitivní epitel, a zárodek se prodlužuje. Následující vývoj larev již probíhá odlišně. Dceřinou sporocystu pak lze od cerkárie rozlišit ve stadiu, kdy je vytvořen tegument. Dceřiná sporocysta má v tomto stadiu charakteristické červovité vzezření a její tělní dutina obsahuje množství zárodečných buněk. Pro cerkárie s vytvořeným tegumentem je charakteristická přítomnost penetračních žláz.
|
|
|
Mikromanipulace a kryopreservace zárodečných buněk ryb
LINHARTOVÁ, Zuzana
Vytváření chimér zárodečných linií je v současné době jedním z poutavých témat výzkumu v oblasti rybářství. Tato metoda má potenciál zabezpečit nebo zvýšit produkci gamet druhů, které jsou komerčně velmi cenněné, ohrožené nebo druhů s problematickou reprodukcí a to za použití běžně dostupného druhu přizpůsobeného k umělému výtěru jako producenta těchto gamet. Hlavním cílem této technologie je získání generačních ryb malých rozměrů (host) produkující reprodukčně funkční gamety druhu původního (donora) po transplantaci zárodečných kmenových buněk donora do hosta. Klíčovými faktory pro vytvoření této biotechnologie je velké množství předběžných experimentů: dokumentace embryonálního a larválního vývoje donora i hosta, charakterizace zárodečných kmenových buněk společně s dokumentací jejich migračních aktivit, sterilizace hosta, izolace a kryoprezervace zárodečných buněk donora. Všechny tyto pokusy byly hlavním cílem této práce. V této práci jsme se zabývali dvěma odlišnými taxonomickými skupinami ryb. Nejprve naší hospodářsky využívanou rybou, línem obecným, kde bychom chtěli uplatnit své dosažené znalosti k vytvoření chiméry zárodečné linie u kaprovitých ryb za pomocí transplantace zárodečných buněk lína (donora) do menšího a rychleji se rozmnožujícího druhu, kterým je kardinálka čínská. Dále jsme se zaměřili na jesetery, skupinu ryb zahrnující celou řadu ohrožených druhů (evidovaných v Červené knize ohrožených druhů (IUCN)), ryby dosahujících velkých rozměrů a zpravidla s dlouhým reprodukčním cyklem. V tomto případě jsme si vybrali jesetera malého jako hosta kvůli kratšímu reprodukčnímu intervalu a menší velikosti těla, k produkci gamet donora, kriticky ohroženého druhu s dlouhým reprodukčním cyklem, jakým je vyza velká. Touto inovativní technologiií bychom mohli získat spermie a jikry v kratším časovém intervalu a od menšího druhu. V případě lína obecného, jsme se nejprve zaměřili na dokumentaci jeho embryonálního a larválního vývoje společně s popisem původu a migračních aktivit primordiálních zárodečných buněk (PGCs). Tyto buňky byly vybrány jako vhodný prostředek pro vytvoření chiméry zárodečné linie v rámci druhu, jelikož nesou genetickou informaci obou rodičů a jsou schopné samovolně migrovat do míst výskytu budoucích gonád (Linhartova a kol., 2014a). Poté jsme vyvinuli praktické metody pro izolaci a kryopreservaci pozdějších vývojových stádií kmenových zárodečných buněk (GC), spermatogonií (SG) a spermatocytů (Linhartova a kol., 2014b). V případě jeseterovitých ryb, Saito a kol. (2014) popsal migrační aktivitu i samotný původ PGCs, který se soustředuje do vegetativního pólu jikry, stejně jako je to známo u obojživelníků. Dále Pšenička a kol. (2015) popsal izolaci a kryopreservaci GC, zastoupených převážně SG a OG a previtellogeními oocyty, 2-4 letých jeseterů sibiřských. Izolované GC byly transplantovány do hosta (jesetera malého) a úspěšně kolonizovaly jeho zárodečnou rýhu. Na závěr jsme se zabývali sterilizací hosta, jesetera malého, potenciálního hosta pro transplantaci zárodečných buněk donora. Snahou bylo dosáhnout sterility pomocí knockdownu specifického genu zárodečných buněk látkou morfolino antisense oligonukleotid (MO) dndMO. Naše výsledky popisují první spolehlivě fungující způsob sterilizace jeseterovitých ryb (Linhartova et al., manuskript). Navíc jsme publikovali důležité informace o morfologii a ultrastruktuře spermií vyzy velké pomocí skenovací a transmisní elektronové mikroskopie, rozšiřující znalosti o stavbě spermií a týkající se i evolučních a taxonomických vztahů mezi jesetery (Linhartova et al., 2013). Tato práce představuje několik studií s odlišnými zaměřeními, ale s jedním hlavním cílem - vytvoření chimér zárodečných linií u ryb. Všechny tyto výsledky jsou předpokladem pro budoucí aplikaci této technologie.
|
|
|
Isolation of early stages of germ cells in pikeperch (\kur{Sander lucioperca})
GÜNGÖR, Ege
Tato studie popisuje techniku enzymatické disociace a izolace raných stádií zárodečných buněk (eGC), zahrnující spermatogonie a spermatocyty candáta obecného (Sander lucioperca) (Percidae, Teleostei). Jejich potenciál diferencovat se do funkčních gamet a přenášet genetickou informaci do dalších generací z nich dělá vhodného kandidáta pro kryoprezervaci a tvorbu chimér. Pro zvolení vhodného věku pro izolaci byly testovány dvě skupiny candátů lišící se věkem (14 a 18 měsíců stáří). Díky vyšší průměrné hmotnosti gonád (0,513 g) se jako vhodnější ukázali 18 měsíční samci candáta obecného. Pro enzymatickou disociaci testes bylo použito 10 ml PBS s 0,3% trypsinu (304 mOsm/kg, pH 8). Testikulární buňky byly následně tříděny centrifugací v hmotnostním gradientu Percollu. eGCs byly identifikovány na základě jejich ploidní úrovně s použitím CYSTAIN DNA 1 kitu (PARTEC) a morfologických charakteristik s použitím světelné mikroskopie. Buňky byly počítány na histologických řezech a po použití Percoll gradientu metodou náhodných čtverců. Metoda izolace zvýšila zastoupení eGC ze 41,3% na 84,7% získané z 33% koncentrace Percollu.
|
host ::
RSS.